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正文:

詳細(xì)解說(shuō)定位雜交的原理和步驟

首先 in situ hybridization 中文叫做原位雜交, 跟南方或北方點(diǎn)墨法最大的不同,是可以看到目標(biāo)的正確位置, in situ 就是這個(gè)意思 ,

所以雖然點(diǎn)墨法的敏感度遠(yuǎn)大于 in situ hybridization ,但仍有許多實(shí)驗(yàn)需要眼見(jiàn)為憑,或是知道正確位置,故原位雜交技術(shù)歷久不衰,

所以要進(jìn)行這個(gè)實(shí)驗(yàn)基本要求是目標(biāo)(target)的完整性與正確性,如果是做染色體的,需要將完整的46條固定在玻片上(以人為例),若是

做胚胎發(fā)育的,需要小心的水解完整的胚胎,做病理切片的要小心去除封蠟,總之ISH第一步就是要準(zhǔn)備好目標(biāo)

第二步要準(zhǔn)備DNA探針,10多年前多用成色法或是Isotope,但成色法解析度太差,Isotope又太危險(xiǎn), 所以現(xiàn)在ISH的技術(shù)都採(cǎi)用螢光

標(biāo)定(Fluorescence) 即現(xiàn)在大家最常聽(tīng)到的原位雜交 Fluorescence in situ Hybridization; 簡(jiǎn)稱FISH 后來(lái)FISH衍伸其他技術(shù)例如

GISH, CGH, SKY 等等,但無(wú)論何種方法都是把螢光物質(zhì)標(biāo)定在DNA之上

第三步進(jìn)行雜交 如果你的目標(biāo)是DNA 則玻片和探針都要進(jìn)行denature之后,降溫,讓探針附著在目標(biāo)上,若目標(biāo)是RNA則不需要,當(dāng)

然這其中牽涉到許多buffer的控制,溫度的微調(diào),以及清洗的效果等等,這些都是要靠經(jīng)驗(yàn)去調(diào)整的

最后一步,需要ㄧ臺(tái)螢光顯微鏡, 現(xiàn)在螢光顯微鏡配上四個(gè)濾片應(yīng)該不是很貴,大概30萬(wàn)就可以搞定了,但最重要的還是ㄧ雙有經(jīng)驗(yàn)的

眼睛去找出你的目標(biāo)固定在何處,不然花花綠綠的螢光影像讓人眼花撩亂,是需要ㄧ段時(shí)間訓(xùn)練才能找出正確目標(biāo)的

我在今年的FISH研討會(huì)上看到有廠商推出可以自動(dòng)尋找目標(biāo)的螢光顯微鏡,很神奇,大概80萬(wàn)左右吧,我猜,這樣可以省掉訓(xùn)練初學(xué)者

的時(shí)間,但可能又要花一些學(xué)軟體的時(shí)間

出自http://www.bjsgyq.com/北京顯微鏡百科