安非他命對(duì)NMDA在大白鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞上所引起45Ca2+蓄積之作用

在大白鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生的細(xì)胞凋零的特征

1)安非他命是一種精神刺激劑，有關(guān)安非他命的中樞神經(jīng)作用的研究過(guò)去大都著重在與多巴胺神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)的關(guān)系，然而最近有許多證據(jù)顯示安非他命所造成的行為敏感化作用 (behavior sensitization) 能被N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA) 的拮抗劑所阻斷， NMDA受體的活化參與了安非他命的中樞神經(jīng)的作用。過(guò)去本實(shí)驗(yàn)室利用[3H]TCP受體結(jié)合的方法及45Ca2+ accumulation的實(shí)驗(yàn)，觀察安非他命對(duì)NMDA受體的作用，結(jié)果顯示安非他命可以直接抑制NMDA受體的活化。在本實(shí)驗(yàn)中我們將再次確認(rèn)安非他命可以抑制NMDA所引起的45Ca2+ accumulation，并且比較右旋 (d-amphetamine)、左旋安非他命 (l-amphetamine)及甲基安非他命(Methamphetamine)對(duì)NMDA所引起的45Ca++ accumulation是否具有抑制作用及其個(gè)別的強(qiáng)度。

結(jié)果顯示，安非他命是NMDA的拮抗劑且安非他命對(duì)NMDA引起的45Ca2+ accumulation有兩階段的抑制作用。而不同結(jié)構(gòu)的安非他命對(duì)NMDA引起的45Ca2+ accumulation的抑制作用強(qiáng)度是差不多的。

(2) Apoptosis (細(xì)胞凋亡)又稱為Programmed cell death (計(jì)劃性細(xì)胞死亡)，顧名思義，它是由細(xì)胞自行調(diào)控死亡，是一種選擇性的主動(dòng)死亡方式。本實(shí)驗(yàn)利用大白鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)觀察apoptosis的現(xiàn)象，我們發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，神經(jīng)細(xì)胞的密度漸漸降低而且有許多細(xì)胞呈現(xiàn)apoptosis的特征包括神經(jīng)細(xì)胞縮小、核質(zhì)濃縮、及產(chǎn)生許多apoptotic bodies等。因此我們判定這種神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)有自生性的apoptosis，根據(jù)此種觀察，我們想要利用其它重要方法來(lái)確定此種判斷。我們除了利用倒立式相位差顯微鏡直接觀察并照下神經(jīng)細(xì)胞的外型之外，并且以LDH response測(cè)量細(xì)胞毒性，及利用TUNEL assay 偵測(cè)apoptosis的細(xì)胞，以及利用RT-PCR的方法偵測(cè)一些mRNA的表現(xiàn)量，包括bax、c-fos、c-jun等。此外，我們并分別在神經(jīng)細(xì)胞離體外培養(yǎng)第6、12、18天時(shí)投與NMDA、MK-801、morphine、naloxone等藥物觀察它們對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響，瞭解他們是否會(huì)促進(jìn)或抑制神經(jīng)細(xì)胞的apoptosis。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)大白鼠大腦皮質(zhì)初代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) (rat primary neuronal cell culture)中有自發(fā)性的apoptosis，可作為一種研究apoptosis的模式。而且直接以顯微鏡及以TUNEL assay觀察都發(fā)現(xiàn)：apoptosis細(xì)胞的數(shù)目會(huì)隨著培養(yǎng)天數(shù)增加而上升。再偵測(cè)培養(yǎng)1到22天的細(xì)胞的mRNA，以ß-actin作為internal control，發(fā)現(xiàn)c-fos mRNA的量在第20天有明顯的上升，但是NSE、NF-M、bax、c-jun mRNA在不同天數(shù)則沒(méi)有明顯差異。在第6天的culture上不論NMDA、MK-801、morphine、naloxone對(duì)細(xì)胞內(nèi)LDH釋放的量都沒(méi)有明顯的作用，細(xì)胞型態(tài)在不同時(shí)間也沒(méi)有明顯變化，但是投與NMDA與MK-801會(huì)降低c-fos mRNA的量。在第12、18的細(xì)胞投與NMDA與MK-801則會(huì)降低NSE和NF-M mRNA的量。在第12天、18天的culture上NMDA組的LDH值比control組高，在倒立式相位差顯微鏡下觀察到NMDA組細(xì)胞外型呈現(xiàn)明顯的necrosis，到24小時(shí)細(xì)胞已明顯的死亡(Figure 27,29)，此時(shí)以TUNEL assay偵測(cè)apoptosis的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)neuron的數(shù)目較少，而且存活下來(lái)的細(xì)胞也幾乎100%發(fā)生apoptosis。可見(jiàn)得NMDA會(huì)同時(shí)造成neuron的necrosis與apoptosis。