細(xì)胞內(nèi)胞器或蛋白質(zhì)分布,免疫染色,顯微鏡與基因轉(zhuǎn)染技術(shù)!

在細(xì)胞繼代培養(yǎng)中，我們使用37度水浴預(yù)熱培養(yǎng)液及Trypsin溶液，是為了達(dá)到恒溫動(dòng)物的體溫范圍，為細(xì)胞適應(yīng)的正常溫度。培養(yǎng)液中的成分有胎牛血清作為養(yǎng)分來(lái)源、抗生素以及胺基酸。Trypsin溶液為可破壞細(xì)胞黏著性的物質(zhì)，故其可使細(xì)胞脫離培養(yǎng)基底，而血清中含有破壞Trypsin的物質(zhì)，所以當(dāng)加入含10 % 胎牛血清之DMEM培養(yǎng)液時(shí)可終止Trypsin的作用

運(yùn)用了抗體與抗原高度專一結(jié)合的特性，進(jìn)行免疫染色法�？乖瓰槟艽碳ち馨图�(xì)胞產(chǎn)生抗體的異己蛋白質(zhì)；抗體分單株抗體和多株抗體，單株抗體是由已經(jīng)建立的融合瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的而多株抗體為動(dòng)物生產(chǎn)的傳統(tǒng)抗血清。免疫染色法即先使用一級(jí)抗體辨識(shí)已知會(huì)位在特定胞器的抗原，再使用具有螢光標(biāo)定的抗一級(jí)抗體的二級(jí)抗體，辨識(shí)一級(jí)抗體及抗原的所在位置，由此得知胞器的所在。之所以使用二級(jí)抗體，是使其將一級(jí)抗體的訊號(hào)放大，再使用螢光標(biāo)定其位置。

還運(yùn)用了基因轉(zhuǎn)染（gene transfection）的方法，將VSVG-GFP以及ARL1QL的質(zhì)體送入細(xì)胞中。而基因轉(zhuǎn)殖根據(jù)不同的運(yùn)送模式可分為三種：物理性方法、化學(xué)性方法和重組病毒感染法。較常用的方法有物理性的電穿孔法、化學(xué)性以DNA-磷酸鈣顆粒經(jīng)胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞以及我們本次實(shí)驗(yàn)的以脂質(zhì)體媒介包埋。以脂小體為載體將DNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)的方式，其主要機(jī)制雖不全然清楚，但知DNA帶負(fù)電之磷酸根會(huì)與脂小體表面之正電荷結(jié)合，脂小體帶正電荷的部分又會(huì)與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的分子結(jié)合藉以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。另外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們?cè)�有脂小體造成細(xì)胞死亡的經(jīng)驗(yàn)，由此得知脂小體對(duì)細(xì)胞有傷害性。而事實(shí)上，只要細(xì)胞接受了轉(zhuǎn)染作用，不管是用哪種轉(zhuǎn)染法，對(duì)細(xì)胞的毒殺性是普便存在的。市面上各種不同的脂小體主要的差異是在它們脂質(zhì)的成分、比例，而這些脂質(zhì)有許多都是因?yàn)橐�增加轉(zhuǎn)染的成功率，所特地制造出來(lái)的化學(xué)成分，亦即它們對(duì)細(xì)胞膜而言不是天然的組成，所以推測(cè)脂小體對(duì)細(xì)胞的毒殺性是因?yàn)檫@些外生性的脂質(zhì)所造成的。

實(shí)驗(yàn)觀察中，我們運(yùn)用了特定的抗原必然和特定的抗體相結(jié)合這一個(gè)事實(shí)，使帶螢光標(biāo)記的抗體和胞器中的抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，這樣兩者的結(jié)合體就能透過(guò)抗體的螢光觀察到。而利用螢光蛋白或具有螢光標(biāo)定的抗體標(biāo)示蛋白質(zhì)的原理為，當(dāng)螢光物質(zhì)（螢光染劑）受到較短波長(zhǎng)的光及足夠的能量所激發(fā)，當(dāng)要回到穩(wěn)態(tài)的能階時(shí)，會(huì)釋出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的螢光，如：來(lái)自水母的綠色螢光蛋白基因，其激發(fā)光譜約為488nm，釋放光譜約為507nm。

結(jié)論

（一）透過(guò)該次的實(shí)驗(yàn)，讓我們得知要了解細(xì)胞內(nèi)胞器或蛋白質(zhì)的分布，免疫染色、顯微鏡與基因轉(zhuǎn)染的技術(shù)是相當(dāng)重要的。

（二）觀察運(yùn)輸系統(tǒng)的存在。CTB-594是一種細(xì)菌毒蛋白質(zhì)，會(huì)經(jīng)內(nèi)胞作用而運(yùn)送至高基氏體；Tf-488 nm是一種運(yùn)鐵蛋白質(zhì)，也會(huì)經(jīng)內(nèi)胞作用而運(yùn)送至高基氏體；而VSVG-GFP是在細(xì)胞內(nèi)合成后，會(huì)經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)送至高基氏體，再運(yùn)送至細(xì)胞膜。

（三）證明ARL1分子會(huì)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的運(yùn)輸作用。因?yàn)榇罅勘憩F(xiàn)其突變株（ARL1QL），造成VSVG-GFP無(wú)法順利送至細(xì)胞膜上，而堆積在高基氏體。


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