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標(biāo)題:PcR法以其快速、靈敏特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用在轉(zhuǎn)化子的篩選

信息分類(lèi):站內(nèi)新聞   作者:yiyi發(fā)布   時(shí)間:2017-2-26 21:17:55 將本頁(yè)加入收藏

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正文:

PcR法以其快速、靈敏特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用在轉(zhuǎn)化子的篩選

   PCR擴(kuò)增的優(yōu)化
  特異性、忠實(shí)性和有效性是檢測(cè)PCR擴(kuò)增的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。三者有時(shí)
不可兼得,高特異性的反應(yīng)條件與高產(chǎn)量的反應(yīng)條件并不一致,高
保真的擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致低產(chǎn)率。因此應(yīng)該
    根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?yōu)化反應(yīng)條件。
    PCR擴(kuò)增的特異性主要是由引物的特異性和循環(huán)參數(shù)來(lái)決定的
。循環(huán)參數(shù)中最主要的是退火溫度和退火時(shí)間。提高退火溫度和降
低退火時(shí)間能有效地提高反應(yīng)的特異性。減少延伸時(shí)間、減少ngE
酶量、減少循環(huán)次數(shù)能提高特異性。
    采用高保真的了kgE可以降低反應(yīng)產(chǎn)物的變異,但其擴(kuò)增效率
有可能降低。
    由于制備模板DNA分子時(shí),會(huì)產(chǎn)生一定量的單鏈DNA分子,這些
單鏈非靶DNA分子在低溫下能與引物退火,隨后的擴(kuò)增反應(yīng)能產(chǎn)生
非特異性擴(kuò)增。
   PcR法以其快速、靈敏的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用在轉(zhuǎn)化子的篩選上。傳
統(tǒng)的篩選轉(zhuǎn)化菌落需要提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR檢測(cè),考慮到PCR擴(kuò)增對(duì)
模板的純度要求不高,因此可以直接用菌落擴(kuò)增,而不用先提取質(zhì)
粒后再擴(kuò)增篩選。PCR引物既可以是插入基因的特異引物,也可以
是載體多克隆位點(diǎn)兩端的引物(如T7、T3、SP6、M13等)。采用基因
特異引物可直接篩選出目的克隆,而用多克隆位點(diǎn)兩端的引物可以
得到插入片段長(zhǎng)度的信息。










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