DNA末端標(biāo)記技術(shù)
由于核酸內(nèi)切酶的作用，凋亡細(xì)胞DNA降解產(chǎn)生缺口和3-OH末端，所以在組織
切片或固定細(xì)胞上選用標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行原位標(biāo)記。其中一種方法稱為原位
缺口轉(zhuǎn)譯(In situ nick translation)，另一種方法為末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的
dUTP末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-nediated dUTP nick
end labeling, TUNEL)。以上方法中，DNA片段的3-OH末端可在DNA聚合酶或
TdT作用下，用生物素(Biotin)、地高幸(Digoxin)、放射性核素(Radionuclide)或
螢光素(Fluorescein)連接的dUTP進(jìn)行標(biāo)記，生物素和地高辛標(biāo)記可通過組織化學(xué)
法顯示，放射性核素用放射自動顯影，螢光素可在螢光顯微鏡下觀察，也可以
流式細(xì)胞儀測定。TUNEL技術(shù)的敏感性更高。DNA末端標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：
(1)能夠在組織切片上辨別形態(tài)學(xué)早期難以辨別的凋亡細(xì)胞；
(2)與流式細(xì)胞儀
(Flow cytometry)分析結(jié)合，可定量測定凋亡細(xì)胞的百分比；
(3)與免疫螢光染色
結(jié)合，可辨別不同細(xì)胞的凋亡情況。
流式細(xì)胞儀分析
流式細(xì)胞儀可從以下途徑反映凋亡細(xì)胞的特性：
(1)DNA含量：由于DNA分子被降解，DNA特異性螢光染色減少。
(2)細(xì)胞膜的完整性：凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜始終保持完整，在細(xì)胞膜通透性處理前
不被碘化丙啶染色，壞死細(xì)胞則被染色；細(xì)胞膜通透性處理后再染色時(shí)，凋亡
細(xì)胞的螢光強(qiáng)度低于正常細(xì)胞。因此，運(yùn)用不同的核酸染色可區(qū)分凋亡細(xì)胞、
壞死細(xì)胞和正常細(xì)胞。
(3)粒線體與溶酶體：凋亡細(xì)胞的粒線體跨膜電位仍然存在，因此可滯留染料
Rhodamine 123。凋亡細(xì)胞保持了ATP依賴性溶酶體質(zhì)子幫浦活性。
(4)蛋白質(zhì)：凋亡細(xì)胞中蛋白酶激活后，蛋白質(zhì)含量減少，因而以
Sulforhodamine 101(SR 101)染總蛋白，凋亡細(xì)胞較正常細(xì)胞少，而壞死細(xì)胞僅
微量。
(5)凋亡細(xì)胞：凋亡細(xì)胞前向散射減少，側(cè)向散射不變或升高。
利用流式細(xì)胞儀來檢測凋亡細(xì)胞特性的方法有：
(一)亞G1峰的檢測法
處于增殖周期的細(xì)胞，根據(jù)其所處不同周期時(shí)期(G0/G1、S和G2/M)，其DNA含
量分布在2n~4n之間。發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞由于細(xì)胞核內(nèi)DNA裂解成許多小片
段，在酒精固定后，用細(xì)胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過細(xì)胞膜而丟
失，僅剩下大片段DNA這些失去部分DNA含量的細(xì)胞，在DNA染色后，形成一
個(gè)DNA含量小于2n(即小于G1時(shí)期細(xì)胞)的分布區(qū)，稱為亞G1峰。
在經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生凋亡的細(xì)胞，在其DNA含量的組方圖(Histogram)上，在G1峰前
會出現(xiàn)一個(gè)呈高斯分布的峰，即為亞G1峰，從分析峰的百分比即可得出凋亡細(xì)
胞的百分比。而在正常細(xì)胞或會自發(fā)性產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞，其亞G1峰的百分
比不會超過5%。另外，發(fā)生壞死的細(xì)胞或機(jī)械性損傷的細(xì)胞在G1峰前不會呈現(xiàn)
高斯分布的亞G1峰，但可出現(xiàn)一個(gè)連續(xù)的DNA小片段分布曲線，以此就可和細(xì)
胞凋亡區(qū)分開來。
(二)末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)
凋亡細(xì)胞是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活，細(xì)胞核DNA被切割成許多雙股
DNA片段以及高分子量DNA斷裂點(diǎn)(缺口)，暴露出大量3’-OH末端，如果用帶有
綠色螢光(FITC)的末端轉(zhuǎn)移酶和帶有紅色螢光(PI)來將細(xì)胞染色，這種帶有雙重
螢光訊號的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀分析后，則可顯示出不同細(xì)胞周期時(shí)期的細(xì)胞凋
亡情況。
在利用此測定方法和經(jīng)流式細(xì)胞儀分析后，凋亡細(xì)胞的表現(xiàn)為可被PI和FITC同
時(shí)染色，而未進(jìn)行細(xì)胞凋亡的細(xì)胞僅會被PI染上螢光，因此可利用這樣方式將
凋亡的細(xì)胞和非凋亡的細(xì)胞區(qū)分開。

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