內(nèi)生荷爾蒙組織上定位步驟

光學(xué)顯微鏡下鏡檢及照相

1. 取樣與固定
隨機選取愈合組織誘導(dǎo)時期及移至分化培養(yǎng)機后0、3、6天的愈合組
  織以FAA固定液〔福爾馬林：冰醋酸：70％酒精＝5：5：90（v/v/v）〕于
  室溫下固定24小時，再換至70％酒精中，置于4℃冰箱貯存。
2. 脫水
將樣品以第三級丁醇（t-butanol）和乙醇的溷合液（TBA-series）進行
   逐步脫水，操作流程如下：
(1) t-butanol：95％ethanol：H2O（10：40：50）﹕2小時
(2) t-butanol：95％ethanol：H2O（20：50：30）﹕2小時
(3) t-butanol：95％ethanol：H2O（35：50：15）﹕2小時
(4) t-butanol：95％ethanol（55：45）﹕2小時
(5) t-butanol：100％ethanol（75：25）﹕2小時
(6) t-butanol （內(nèi)含少量safranin使樣品染成紅色，易于觀察組織位置與方向）﹕2小時
(7) t-butanol﹕隔夜
3. 滲臘及包埋
固定瓶中加入約半量的石臘，于烘箱中約60℃下使之融解，待烘箱降溫，使石臘自然冷卻凝固。將已處理至第三級丁醇的樣品，放入含有石臘之固定瓶中，再加入適量的第三級丁醇，放回烘箱中，調(diào)整溫度至55℃，使第三級丁醇逐漸揮發(fā)，并使石臘融解而進行滲臘。待第三級丁醇揮發(fā)完全后，再換一次石臘，繼續(xù)滲臘，待樣品滲臘完全后，再進行包埋。
將完成滲臘的樣品自烘箱取出，用酒精燈加溫使石臘不致于冷卻凝結(jié)。將包埋用的磁盤先涂上一層甘油（glycerol），同時置于酒精燈上加溫，以維持磁盤的溫度約50℃左右防止石臘倒入時會太快凝結(jié)。將固定瓶中的石臘與樣品一同倒入磁盤中，在融臘狀態(tài)下調(diào)整樣品在磁盤中的位置及方向，待其完全凝固，再自磁盤中取出整個臘塊進行切片。
4. 切片
首先將清潔的載玻片浸入黏著劑《adhesive：0.5％gelatin、0.05％chrome album、少數(shù)防腐劑（thymol）》，十五分鐘后取出自然干燥。將已包埋好的樣品臘塊修飾成適當大小的立方塊，黏于軟木塞并置于切片臺上。以10 m的厚度進行切片，同時將前述之載玻片上滴加適量蒸餾水，再將臘帶置于蒸餾水上，移至約45℃的溫板上，待臘帶延展之后，將蒸餾水吸干，將樣品放在40℃-45℃的環(huán)境下，烘干后即可進行以下的試驗。
5. 脫臘及染色
制備完成的樣品切片，其脫臘及染色的步驟如下：
(1) xylene  2次，10分鐘/次
(2) xylene：100％ 酒精 （1：1）  1次，10分鐘/次
(3) 酒精系列：濃度序列分別為100％、95％、85％、75％、50％                          各1次，5分鐘/次
(4) 1％safranin（溶于50％酒精中）             1次，2小時
以蒸餾水將多余的染劑洗除，即可進行組織免疫的試驗。
6. 組織免疫化學(xué)法
本試驗依據(jù)Brandtzaeg（1982）、Knox（1982）、Grzanna（1982）、
   Burns（1982）等人的方法稍加修飾，其操作步驟如下：
(1) 將已染色的樣品置于免疫反應(yīng)盒中，加入蒸餾水浸潤3次（10分 鐘/次），再以TBST緩沖液（Tris-Buffer Saline-Tween 20, TBST，附注1）浸潤3次（10分鐘/次）。
(2) 添加一級抗體（初級，primary antibody）
 將反應(yīng)盒中的TBST緩沖液盡量倒干，加入一級抗體（附注2），
 置于4℃、黑暗中反應(yīng)24小時。
(3) 添加二級抗體（二級，secondary antibody）
 將一級抗體倒出，以TBST緩沖液清洗3次（10分鐘/次），再將盒中的TBST緩沖液盡量倒干，將樣品換至新的反應(yīng)盒中，加入二級抗體（附注3），置于4℃、黑暗中反應(yīng)12小時。
(4) 添加SAP酵素
 將二級抗體倒出，以TBST緩沖液清洗3次（10分鐘/次），再將盒中的TBST緩沖液盡量倒干，將樣品換至新的反應(yīng)盒中，加入SAP
 溶液（附注4），置于4℃、黑暗中反應(yīng)5小時。
(5)呈色
將SAP溶液倒出，以TBST緩沖液清洗3次（10分鐘/次），再將盒中的TBST緩沖液盡量倒干，將樣品換至新的反應(yīng)盒中，加入呈色劑（附注5、6），置于室溫、黑暗中進行呈色反應(yīng)，約2小時，依呈色之深淺調(diào)整呈色時間。
7. 封片與觀察
(1) 用蒸餾水將多余的呈色劑洗除。
(2) 將樣品置于50％、75％、85％、95％酒精，各1次（5分鐘/次），再
   置于100％酒精中3次（10分鐘/次）
(3) xylene：100％酒精（1：1），2次（10分鐘/次）
(4) xylene 2次（10分鐘/次）
(5) 以Entellen膠（Merck）封片，于光學(xué)顯微鏡下鏡檢及照相。
附注1. TBST緩沖液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、0.3％Tween 20 （v/v），調(diào)整pH值為8.2。
附注2. 一級抗體藥品來源及配制
PAb-IAA：購自Phytoscience，Catalog No.AC312（1 mg/瓶）
PAb-ABA：購自Phytoscience，Catalog No.AC122（1 mg/瓶）

上述單株抗體由老鼠血清取得。
將各瓶一級抗體加入1 ml TBS 緩沖液及1 ml glycerol，溷合均勻，每50 l 分裝至小離心管作為儲存液，置于-20℃冰箱中。使用時，將貯存液以TBST緩沖液稀釋500倍（v/v）。2種荷爾蒙的稀釋倍數(shù)皆相同。
附注3. 二級抗體藥品來源及配制
二級抗體購自PIERCE，代號：31800（2 mg/ml/瓶），為山羊抗老鼠血清（IgG（H＋L））抗體，其上接有biotin。使用時以TBST緩沖液稀釋1000倍（v/v）。
附注4. SAP溶液藥品來源及配制
SAP 購自PIERCE，代號：21324（1 mg/瓶），可與biotin 聯(lián)接。先以2 ml 蒸餾水溶解作為儲存液使用時將貯存液以TBST緩沖液稀釋1000倍（v/v）。
附注5. 呈色劑
Nitro blue tetrazolium chloride（NBT）：購自PIERCE，代號：34035，每0.5克溶于10 ml 70％ dimethylformamide中。
5-Bromo-4chloro-3-indolyl-phosphate（BCIP）：PIERCE代號：34040，每0.5克溶于10 ml 100％ dimethylformamide中。
附注6. 使用液配制：取100 l NBT及50 l BCIP加入15 ml的堿性磷酸酵素緩沖液（alkaline phosphatase buffer），必需新鮮備制使用。
alkaline phosphatase buffer﹕100 mM NaCl、5 mM MgCl2•6H2O及100 mM Tris，調(diào)整pH值為9.5

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