根段培養(yǎng)and有絲分裂周期的測定步驟

種植與萌發(fā)
1. 將豌豆種子以未稀釋之漂白水chlorox攪拌6-7分鐘。
2. 在無菌操作臺將豌豆倒在覆有紗布的燒杯上。用火消毒鑷子后將植物種子種在無菌的蛭石盆中。澆灌一瓶無菌水。把下種后的蛭石盆放在暗處4-5天，根部將可長到3-6 cm長。（注意計時）
4.    在剪下萌芽的根之前24小時，將下列器具放置在無菌接種臺進行紫外光（UV light）照射。
a）大培養(yǎng)皿的底部（作為切割板）。
b）兩個無菌的二次蒸餾水滴瓶。
c）一只鑷子。
d）一只外科用刀片和刀柄。
e）全部以鋁箔及紙巾包覆后，放在有鋁箔覆蓋的鋼盤上。
f）將培養(yǎng)用三角瓶放置在無菌臺之外。
根尖的切除
1. 用酒精燒烤培養(yǎng)皿且使其冷卻；燒烤解剖工具且使其冷卻下來。（注意：工具必需總是保持無菌狀態(tài)，但不是熱的。）
2. 放置幾滴無菌水在培養(yǎng)皿內(nèi)且移出足夠的豌豆苗（12株），足供一三角瓶之培養(yǎng)。
3. 自每一個根段切下尖端1公分。切完12個根尖之后，打開三角瓶，以火燒烤瓶頸且小心把根放入三角燒瓶后覆蓋瓶口。重復(fù)此切根步驟。直到4個燒瓶全取樣完成。

培養(yǎng)，后標定與取樣
1. 24小時后，加入0.025 ml 3H-TdR（講員將示范）到每一個燒杯約標定30分鐘。在標定后把根倒入覆有無菌紗布的燒杯上。且使用無菌技術(shù)將根轉(zhuǎn)移到新鮮干凈沒有3H-TdR的新鮮White氏培養(yǎng)液中。
2. 在標定后，用無菌取樣技術(shù)，每4小時取樣四個根尖，即在0、4、8、12、16、20和24小時取樣。（燒烤瓶頸，烤燒長鑷子然后抽檢根尖----在無菌臺中工作）注意：分配取樣時間，或盡可能的錯開試驗。
3. 將取樣的根放置在新鮮的固定液瓶中（100％乙醇：冰醋酸3：1）。把瓶子暫放在冰箱中直到全部的樣品取樣完成。在每一個瓶子內(nèi)投入鉛筆書寫的卡片卷標。
4. 將根進行Feulgen染色且準備壓片。
5. 進行自動放射線顯影------在4℃下進行12天之曝光，即將涂有感光乳劑之玻片接受3H放射線之感應(yīng)作用。
計數(shù)
1. 顯影，封上蓋玻片和記數(shù)含放射線標定且進行細胞分裂的細胞數(shù)之百分比（labelled division figures, ％L.M.F.）。
2. 每一取樣時段至少計數(shù)四段根，每根至少計數(shù)500個細胞。將取樣時間與放射線標定，且進行細胞分裂百分比（％）之關(guān)系作成相關(guān)之坐標圖。
3. 由作圖之?dāng)?shù)據(jù)推算大略的細胞分裂周期之時間，及G1、S、G2、M分別所占之時間。


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